实验室培养的细胞可以根据细胞类型分为三大类。首先是贴壁细胞，这类细胞会粘附在培养容器上（如组织培养塑料）。其次是悬浮细胞，它们以悬浮的方式生长于培养基中，而不附着于任何表面。最后是半贴壁细胞，这类细胞有的附着在培养容器上，有的则在培养基中悬浮。

此外，细胞也可以根据其生长特性进行分类，主要分为有限增殖和无限增殖。有限增殖的细胞仅能维持一定数量的群体活力，常见于从组织中直接分离的原代细胞，或在经历一定次数的传代后停止生长的细胞系。而无限增殖的细胞则具备无限分裂能力（即永生化），通常是通过转化取得类似癌症的表型，如失去接触抑制以及能够无限增长。

在本文中，我们将重点关注最常见的细胞类型：贴壁细胞和悬浮细胞。需要强调的是，所有关于细胞培养的操作均应采用无菌技术及适当的控制方法进行。

第一阶段 冷冻保存

由于遗传不稳定性在持续培养的细胞中不断积累，因此在收到细胞系后应尽快进行冷冻保存。这能确保细胞库在遗传上尽可能接近源材料，并降低污染风险。冷冻过程应在含有冷冻保护剂（如DMSO）的环境中，以可控速度（最好以每分钟1°C的速度）冷冻细胞，以防止细胞内冰晶的产生，进而导致细胞活力丧失。

实验步骤：

1. 使用显微镜观察细胞，检查其整体外观，确保没有微生物污染的迹象，且细胞处于对数增长阶段，活力应大于90%。
2. 按照标准传代培养方法收集并计数细胞，其中悬浮细胞以每毫升2-5×10⁶个细胞的密度冷冻，而贴壁细胞以每毫升1-2×10⁶个细胞的密度冷冻。
3. 选择适合细胞系的冷冻保护剂，计算所需冷冻液的量并配置。
4. 以200×g离心5分钟，去除上清液，将细胞沉淀物重悬于PBS中。
5. 再次以200×g离心5分钟以去除上清液。
6. 用配置好的冷冻液重悬细胞沉淀，充分混匀后转移至冻存管中，并标记重要信息如日期、名称、细胞编号、传代数和细胞类型。
7. 将冻存管放入冻存盒中，在-80°C下放置一夜，控制温度下降。
8. 最终转移至液氮罐中进行长期储存。

第二阶段 细胞复苏

在需要时，应尽快解冻细胞以减小对细胞活力的影响。建议使用离心方法去除冷冻保存剂。

实验步骤：

1. 从液氮中取出冷冻管，放入37°C水浴中，轻轻晃动以加速解冻。当管内细胞解冻至黄豆大小时，取出冻存管。
2. 将冻存管中细胞（1ml）转移至预热培养基（4ml）的离心管中，200-250×g离心5分钟。
3. 除去上清液，用适量预热培养基重悬细胞沉淀，并接种至相应的培养容器。根据细胞类型，添加所需生长因子等成分。

第三阶段 观察

定期使用显微镜和肉眼观察细胞，以检测是否有微生物污染迹象，并评估细胞的健康状况，看是否需要传代培养。

实验步骤：

1. 用肉眼观察细胞培养状态，检查是否有污染。贴壁细胞应使培养基清澈，浑浊可能表明污染或细胞死亡。
2. 通过显微镜检查细胞贴壁情况、细胞形态（监测污染或分化迹象）、融合度（100%表示细胞完全覆盖），以及悬浮细胞的密度。
3. 定期排查支原体污染，同时监控细胞是否有细菌、真菌和酵母的污染迹象。

第四阶段 细胞维持和传代培养

当细胞生长健康并达到所需的融合度时，可以进行传代培养。这样可以继续细胞的生长和实验。同时需定期更换培养基，避免有毒代谢物的累积。

实验步骤：

1. 吸取并更换培养基，根据细胞类型适当处理。
2. 进行传代培养时，清洗并收集细胞，根据细胞类型选择合适的操作步骤。
3. 记录细胞培养的关键信息，标注如细胞类型、传代次数、接种密度等信息，并在培养箱中孵育，继续监测细胞状态。

通过持续的监控和适当的操作，细胞培养可以保持健康状态，为相关研究提供可靠的实验材料。南宫28NG相信品牌力量，将在细胞培养领域为科研人员提供更多支持与帮助。